青島能源所揭示關(guān)鍵門(mén)控殘基提高工程化P450去甲基化酶活性的機理
木質(zhì)素單體化合物的O-去甲基化反應是木質(zhì)素生物降解利用過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一。目前已知的O-去甲基化酶僅有Rieske加氧酶、四氫葉酸(THF)依賴(lài)性的O-去甲基化酶、P450單加氧酶幾種,且普遍存在著(zhù)底物特異性狹窄、反應機理不清和缺乏還原酶伴侶等問(wèn)題,不能滿(mǎn)足工業(yè)化應用的需求。因此無(wú)論是挖掘新的O-去甲基化酶基因資源,還是通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造現有的O-去甲基化酶均具有重要意義。
來(lái)源于沼澤紅假單胞菌HaA2菌株產(chǎn)生的細胞色素CYP199A4單加氧酶是少數已知能夠催化木質(zhì)素單體衍生物去甲基化反應的P450酶之一,然而其去甲基化催化功能高度依賴(lài)煙酰胺輔因子NADH和還原伴侶蛋白。近日,青島能源所叢志奇研究員團隊利用前期提出的H2O2隧道工程策略,構建了CYP199A4過(guò)氧化氫突變酶庫,對21種木質(zhì)素單體類(lèi)似物的O-去甲基化進(jìn)行研究,首次成功構建了木質(zhì)素單體類(lèi)似物間位甲氧基O-去甲基化活性的工程化P450過(guò)加氧酶。在供電子或吸電子基團(甲氧基、硝基、羥基和甲基)取代的木質(zhì)素單體類(lèi)似物的O-去甲基化反應中,工程化CYP199A4過(guò)加氧酶優(yōu)先對位進(jìn)行催化反應,反應總轉化數(TON)已超過(guò)或媲美天然底物4-甲氧基苯甲酸的脫甲基化反應。典型突變體實(shí)現3-甲基-4-羥基苯甲酸的半規模制備,分離產(chǎn)率為59%。研究人員隨即解析了優(yōu)勢突變體的高分辨率晶體結構,結構分析顯示具有較小位阻和疏水性關(guān)鍵門(mén)控殘基的突變酶活性中心的H2O分子總數增加。因為H2O2和H2O分子具有相似的物理性質(zhì),這說(shuō)明H2O2分子也可以容易進(jìn)入到活性中心,從而在分子水平上有力支持了門(mén)控氨基酸殘基調節H2O2分子參與反應的可能機制。研究人員進(jìn)一步采用經(jīng)典動(dòng)力學(xué)模擬及增強采樣技術(shù),對H2O2穿越隧道的能壘進(jìn)行計算,揭示相較于野生型,F182A突變體的隧道勢壘顯著(zhù)降低,增強了H2O/H2O2分子穿越隧道并抵達血紅素活性中心的能力,從微觀(guān)層面上為H2O2隧道工程策略的有效性提供了明確的理論闡釋。這項研究為開(kāi)發(fā)非天然P450過(guò)氧化酶進(jìn)行有價(jià)值化合物的有機轉化提供了新思路,為利用H2O2隧道工程創(chuàng )建P450過(guò)加氧酶的機理上提供了新的見(jiàn)解,有望進(jìn)一步拓展P450酶在合成化學(xué)和合成生物學(xué)中的應用空間。
圖1?關(guān)鍵門(mén)控殘基效應增強工程化CYP199A4去甲基化過(guò)加氧酶活性
相關(guān)工作近日在線(xiàn)發(fā)表于英國皇家化學(xué)會(huì )(RSC)期刊Chemical Science上,青島能源所博士趙盼霞、姜誼平、王謙為論文共同第一作者,叢志奇為通訊作者,本研究得到國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、以及青島能源所自主部署的強基計劃項目等的大力支持(文/圖 趙盼霞、姜誼平、王謙)
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