青島能源所在產(chǎn)L(+)-酒石酸的環(huán)氧化物水解酶催化機制與酶工程研究中取得進(jìn)展
酒石酸作為重要的化工和食品添加劑原料,具有L(+)和D(-)兩種類(lèi)型的對映體,是合成化學(xué)品和藥物時(shí)重要的手性合成子和手性選擇劑。傳統上L(+)酒石酸是葡萄酒產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品,其產(chǎn)量受到自然資源和季節的影響。微生物來(lái)源的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶(CESH)可用于制備高對映體純度的手性酒石酸,是目前工業(yè)生產(chǎn)手性酒石酸的主要方法之一,于上世紀90年代實(shí)現產(chǎn)業(yè)化。雖然CESH是最早得到應用的工業(yè)酶之一,但其催化機制一直未能得到明確解析,從而阻礙了這類(lèi)工業(yè)酶的理性改造與性能提升。解析CESH的催化機制對于這類(lèi)工業(yè)酶的理性改造與性能提升具有重要意義。青島能源所代謝物組學(xué)研究組對產(chǎn)L(+)和D(-)兩類(lèi)酒石酸的CESH[L]和CESH[D]進(jìn)行了長(cháng)期的研究,最近成功解析了CESH[L]的結構與催化機制,相關(guān)工作近期發(fā)表在生化領(lǐng)域期刊《Journal of Biological Chemistry》。
雖然催化相同的底物CES(順式環(huán)氧琥珀酸),但CESH[L]和CESH[D]具有完全不同的序列、結構和催化機制,分別產(chǎn)生高對映體純度的L(+)和D(-)酒石酸。在解析CESH[D]的結構與催化機制的基礎上,研究團隊經(jīng)過(guò)多年努力又成功獲得了兩種CESH[L]的多種不同狀態(tài)的晶體結構,包括不含底物的酶、與底物形成催化中間體的酶突變體、與產(chǎn)物形成復合物的酶突變體的高分辨晶體結構。結構分析表明,CESH [L]以高度特異的方式結合具有鏡像對稱(chēng)結構的底物CES,通過(guò)Asp-His-Glu催化三聯(lián)體實(shí)現兩步催化水解,其中激活水分子的關(guān)鍵催化殘基是一個(gè)Glu,而不是以往研究推測另一位置的Asp,發(fā)現并鑒定出負責為環(huán)氧乙烷上的氧原子提供質(zhì)子以協(xié)助開(kāi)環(huán)反應的氨基酸殘基。這些結果完整地描繪了CESH[L]的立體催化機制,并完美地詮釋了以往研究中的突變分析結果。高分辨結構的解析也為后續進(jìn)一步開(kāi)展CESH[L]理性改造以提升穩定性和催化性能奠定了基礎。
在L(+)酒石酸生產(chǎn)中,通常使用全細胞催化劑或固定化方法來(lái)改善CESH[L]的穩定性。目前使用的全細胞催化劑均為胞內表達CESH[L],細胞膜的通透性影響酶的催化效率和生產(chǎn)性能。代謝物組學(xué)研究組與北京科技大學(xué)宣勁松副教授課題組合作,成功開(kāi)發(fā)了大腸桿菌細胞表面高效展示CESH[L]的技術(shù)。酶活測定結果表明,在大腸桿菌表面展示的CESH[L]酶總量超過(guò)了大腸桿菌胞內過(guò)表達所能達到的酶總量,不存在細胞通透性問(wèn)題,同時(shí)能夠多次重復使用,4攝氏度下可以長(cháng)期保存且幾乎不喪失活性。這一技術(shù)為提升L(+)酒石酸的工業(yè)生產(chǎn)效率提供了新的方案,相關(guān)技術(shù)申請了發(fā)明專(zhuān)利(202210273760.4),2024年4月9日得到授權。
圖1. 產(chǎn)L(+)-酒石酸的環(huán)氧化物水解酶的催化機制與細胞表面展示。
(A)CESH[L]催化中間體的晶體結構。(B)根據結構所推定的CESH[L]的催化機制。(C)大腸桿菌表面展示CESH[L]的全細胞催化劑示意圖、穩定性與復用性。
相關(guān)研究由代謝物學(xué)研究組馮銀剛研究員和崔球研究員、北京科技大學(xué)宣勁松副教授指導完成。研究工作得到了科技部、國家自然科學(xué)基金委、山東能源研究院以及北京科技大學(xué)相關(guān)項目的資助。(文/圖?馮銀剛)
相關(guān)論文和授權專(zhuān)利:
1. Sheng Dong,Jinsong Xuan,Yingang Feng*,Qiu Cui* (2024) Deciphering the stereo-specific catalytic mechanisms of cis-epoxysuccinate hydrolases producing L(+)-tartaric acid. J. Biol. Chem. 300(2):105635. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2024.105635
2. 馮銀剛,宣勁松,周瑞,東升,崔球;順式環(huán)氧琥珀酸水解酶細胞表面展示體系及構建和應用,中國發(fā)明專(zhuān)利ZL202210273760.4,2024年4月9日授權公告。
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